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一、 實驗目的

1、了解透射電子顯微鏡的結構和工作原理。

2、了解透射電子顯微鏡樣品制備的方法。

二、實驗原理.

透射電子顯微鏡是以波長極短的電子束作為照明源，用電磁透鏡聚焦成像的一種高分辨

本領、高放大倍數(shù)的電子光學顯微鏡。透射電鏡的總體工作原理是:由電子槍發(fā)射出來的電

子束，在真空通道中沿著鏡體光軸穿越聚光鏡，通過聚光鏡將之會聚成一束尖細、明亮而又

均勻的光斑，照射在樣品室內的樣品上;透過樣品后的電子束攜帶有樣品內部的結構信息，

樣品內致密處透過的電子量少,稀疏處透過的電子量多;經(jīng)過物鏡的會聚調焦和初級放大后，

電子束進入下級的中間透鏡和第1、第2投影鏡進行綜合放大成像，被放大了的電子影

像投射在觀察室內的熒光屏板上;熒光屏將電子影像轉化為可見光影像以供使用者觀察。

三、透射電鏡的結構

透射電子顯微鏡由三大部分組成: 1、電子光學系統(tǒng)(鏡體):照明源(電子槍聚光鏡)、

成像系統(tǒng)(樣品鏡、物鏡、中間鏡、投影鏡)、觀察記錄系統(tǒng)。2、真空系統(tǒng)。3、電源與控

制系統(tǒng)

四、超薄切片制備技術步驟

透射電鏡的成像是由一定強度的電子束透過標本而成像。由于電子射線的穿透能力比較低，電鏡又具有很高的分辨率和放大率，因此, 電鏡標本需要厚度在0.03～0.05μm的超薄切片，以獲得高分辨的超微結構圖像。

超薄切片制作過程包括取材、固定、脫水、滲透、包埋、聚合、切片和染色等幾個環(huán)節(jié)。

（一）取材

取材是超薄切片技術的關鍵環(huán)節(jié)。由于生物組織離體后，細胞將會立即釋放出各種水解酶引起細胞自溶，使細飽內部微細結構發(fā)生變化。因此，為盡可能避免產(chǎn)生人工假像，取材時有以下要求：

1． 取材要快，一般要求在1min內把組織塊浸入固定液。

2． 組織塊要小，一般切成0.5～1.0mm。

3． 所用固定液及容器須預冷，以降低離體細胞內水解酶的活性，盡可能減少細胞自溶。

4． 由于電鏡觀察視野小，具有很大的局限性，所以，選擇部位要準確可靠。

5． 切割組織的刀、剪必須鋒利干凈，避免拉、鋸、壓等動作造成細胞損傷。

（二）固定

1. 固定的作用 標本固定在于：

①破壞細胞的酶系統(tǒng)，阻止細胞的自溶；

②穩(wěn)定細胞物質成分，如核酸、核蛋白，糖類和脂類，使之發(fā)生交聯(lián)，減少或避免抽提作用，以保存組織成分；

③在一些細胞組分之間以化學反應和物理反應建立交聯(lián)，以提供骨架來穩(wěn)定各種細胞器的空間構型；

④能提供一定的電子反差。

2. 常用的固定劑　理想的固定劑須具備的條件有：

①能迅速滲入組織細胞內，盡快固定細胞以減少組織自溶；

②能穩(wěn)定細胞各種結構成分，使其在脫水、滲透及包埋等過程中不溶解和丟失；

③避免細胞結構膨脹或收縮，以保證獲得真實結構的電鏡圖像；

④能保存酶的活性以供電鏡細胞化學研究。目前尚未找到一種能滿足上述全部功能的理想固定劑，較理想和常用的固定劑有四氧~化鋨、醛類、高錳酸鉀等。

3. 固定方法　目前，用于生物樣品超薄切片技術的主要固定方法是化學固定法。采用戊二醛 (或戊二醛+多聚甲醛)固定l～3h后，經(jīng)相應的緩沖液沖洗，再用1%鋨酸后固定1～2h。

生物樣品有多種多樣，對于不同的材料和組織部位，其固定方式是不同的。

（1）浸泡固定：適用于一些能允許在短時間內停止供血而仍保持其功能和結構的器官或組織，以及一些病理檢查的樣品。其方法是經(jīng)解剖 (或手術)盡快從機體中取出所需組織，并按取材要求，把組織切成小塊，放入小瓶子內作常規(guī)雙重固定。

（2）血管灌注固定：適用于取材較復雜或對缺氧較敏感的器官或組織，須采用血管灌注固定?？筛鶕?jù)動物的大小選用全身灌注或局部灌注的方式。

（3）培養(yǎng)細胞的固定：如所固定材料為微生物、單細胞原生動物、細胞提取物或組織培養(yǎng)的細胞，則應先離心倒去上面的培養(yǎng)液 (或上清液)，然后才按常規(guī)方法進行雙重固定。戊二醛固定時間為15～30min，鋨酸固定時間為15～40min。

對于試管或培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的單層細胞，在傾去培養(yǎng)液后，即加入前固定液，并輕刮下細胞，用2000r/min離心15～20min，使細胞成團。然后傾去上清液，再緩慢加入新鮮的前固定液，以免將細胞團沖散，并繼續(xù)進行雙重固定。

4. 固定時注意事項

（1）固定液的濃度：固定液濃度要適宜。一般戊二醛常用濃度為1％～4％,鋨酸為1％～2％。

（2）固定液的滲透壓：固定液的滲透壓須調節(jié)到接近組織、細胞的生理值。固定液的滲透壓是通過改變緩沖液的濃度或者通過增加鈉、鈣和鎂等電解質或葡萄糖和蔗糖等非電解質來調節(jié)的。

（3）固定液的pH值：固定液pH值須接近所要固定組織的pH值。由于大部分動物組織的平均pH值約7.4, 因此，電鏡固定液的pH值都選用中性 (7.2～7.4)。

（4）固定時的溫度 理論上，低溫能降低酶的活性，減少細胞自溶和胞內物質的抽提，因此，大部分樣品宜在0℃～4℃下固定。

（三）脫水

脫水是指用適當?shù)挠袡C溶劑取代組織細胞中的游離水，因水分的存在會使組織結構在電鏡高真空狀態(tài)下急劇收縮而遭破壞，另外包埋劑是非水溶性的，細胞中的游離水會影響包埋劑的浸透，因此，脫水是一個很重要的步驟。

（四）滲透與包埋

滲透和包埋的目的是取代活組織中的水分以及支持整個結構，以便標本有特定的機械性利于切片。

1. 常用包埋劑及配方　包埋劑種類頗多，目前普遍使用的是環(huán)氧樹脂。為改善包埋塊的切割性能，有時在環(huán)氧樹脂包埋劑配方中再加一些增塑劑，以調節(jié)包埋塊的韌性。

環(huán)氧樹脂包埋劑對細胞微細結構有較好的保存性能，聚合后體積收縮率較小，為2％～5％，而且在真空中能經(jīng)受較長時間的轟擊。但它操作不大方便，反差較弱。

環(huán)氧樹脂的型號較多，常用Epon812、Spur樹脂(ERL-4206) 、TAAB812，還有國產(chǎn)的環(huán)氧樹脂618和600等。

2. 滲透與包埋步驟　樣品在*脫水后，即可進入滲透。將樣品置于100％脫水劑及等量包埋劑的混合液中(室溫下30min或數(shù)h)；第二步是將樣品置于純包埋劑中(室溫6h或過夜),然后可行包埋: 將滲透后的樣品挑入已裝有包埋劑的多孔橡膠模板中，將包埋劑灌滿，放入標簽，然后根據(jù)包埋劑聚合時所需的溫度及時間聚合，制成包埋塊。

（五）超薄切片

超薄切片的面積為0.5mm×0.5mm左右，要切出較理想的超薄切片，不僅超薄切片機質量好，還要有滲透、包埋好的包埋塊，以及要有好的切片刀和操作者技術熟練等。其步驟是：

1. 定位、修塊　定位、修塊是指保留要進行電鏡觀察部分，把其余部分削去，以利進行超薄切片。

2. 制刀　用于超薄切片有鉆石刀和玻璃刀。玻璃刀因價格低廉而被常用。

玻璃刀經(jīng)檢查后的刀還須在刀上作一小水槽，以便在切片時讓切下來的超薄切片漂浮在液面上。為防止漏水，邊沿須用石蠟或指甲油焊封。在焊接時，應注意刀刃不要粘上石蠟或其他的焊封劑，以免損傷刀刃。

3. 載網(wǎng)和支持膜制備　超薄切片須置于一種載網(wǎng)上才能進行觀察。載網(wǎng)一般采用很薄的銅片，此外，還有鎳網(wǎng)、銀、鉬、不銹鋼、尼龍等材料制成的載網(wǎng)。

（六）超薄切片機

超薄切片機有熱膨脹式和機械進刀式兩類，后者較常用，它是以微動螺旋和微動杠桿來提供微小進刀而切出切片，如Leica超薄切片機。

（七）切片染色

（1）染色的作用：所謂電子染色是利用某些金屬鹽(如鉛、鈾、鋨等)能與細胞的某些結構和成分結合，以增加其電子散射能力，進而達到提高反差的一種方法，不同結構成分上吸附有不同數(shù)量重金屬原子，結合重金屬原子較多的區(qū)域(即結構致密、原子序數(shù)高的部分)具有較強的電子散射能力，在電鏡下呈現(xiàn)為電子致密的黑色；結合重金屬原子較少的區(qū)域則為淺黑色，灰黑色，沒有結合重金屬的區(qū)域是電子透明的區(qū)域，因此，經(jīng)過電子染色處理可提高樣品反差，增加圖像清晰度。