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一、 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

表格一：實(shí)驗(yàn)儀器

表格二：試劑

二、 實(shí)驗(yàn)步驟

1、組織中蛋白上清液的制備和濃度測定

把組織剪切成細(xì)小的碎片；

加入 200μL 裂解液，在勻漿機(jī)中研磨，直至裂解液中組織消失；

充分裂解后，12000rpm 離心 5min，取上清。

取部分上清蛋白用 BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按如下步驟：  ①按試劑盒說明書將 A 液和 B 液以 50：1 的比例配制成工作液；

②取 2000μg/mL 的 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品，用 PBS(pH 7.4)稀釋成 2000μg/mL、1500μg /mL、1000μg/mL、

750μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、25μg/mL、0μg/mL 共 9 個濃度梯度；

③取上清液 10μL，用 PBS 稀釋 20 倍；

④每管中加 20μL 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或稀釋后的上清液，再加上述工作液 0.2mL，37℃孵育 30min，

562nm 處測吸光度，記錄 OD 值；

⑤根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及相應(yīng) OD 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計算樣品總蛋白濃度（mg/mL）

2、Western-Blot 檢測總蛋白中目的蛋白表達(dá)。

灌膠

①蒸餾水清洗灌膠玻璃板，豎直晾干。

②配制 13％分離膠 10mL，加 TEMED10μL、10％過硫酸銨 100μL，混勻后立即灌膠，灌至齒梳下緣 2～3mm（事先做好標(biāo)記），用異丙醇封閉液面以去除氣泡并隔絕空氣，室溫靜置 45min 待膠*聚合。

③待分離膠*聚合后，傾去其頂部的去離子水，用濾紙將水吸干。

④配制 4％濃縮膠 5 mL，加 TEMED 5 μL、10％APS 50 μL，混勻立即灌膠，灌至頂部，并垂直插入 Teflon 齒梳，室溫靜置 20 min 待膠聚合。

⑤待膠*聚合后拔出梳子，將凝膠置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，用電泳緩沖液沖洗上樣孔以去除氣泡。

電泳

①取各個處理組蛋白提取液，調(diào)整蛋白濃度為 6μg/μL，和等體積 2×上樣緩沖液混合，即為上樣液。

②將上樣液于 100℃沸水中煮沸 5min，使蛋白變性，冰上驟冷，3000 轉(zhuǎn)/min 離心 1min。

③每孔加上樣液 15μL，留一孔加 10μL 預(yù)染的 Marker。加滿電泳緩沖液，蓋上槽蓋，接通電源，先用 80v 恒壓電泳，約 20min，當(dāng)指示劑溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后改用 110v 恒壓電泳，當(dāng)指示劑到達(dá)距凝膠下端約 0.5cm 處時關(guān)閉電源，取出膠板。

轉(zhuǎn)印蛋白及免疫檢測

①在電泳即將結(jié)束前，預(yù)先將 PVDF 膜浸泡在甲醇中 15s，然后用 ddH2O 漂洗 2min，浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中 5min 后開始后續(xù)操作。

②在水中撬膠，修膠后將膠浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡 15min。

③按黑面（負(fù)極）→海綿→濾紙→膠→PVDF 膜→濾紙→海綿→紅面（正極）的順序制備轉(zhuǎn)膜“三明治”，每層鋪好后先趕走氣泡再鋪另一層。在轉(zhuǎn)移緩沖液中制備三明治可避免氣泡的產(chǎn)生。

④接上正負(fù)極，按膜向正極的方向?qū)⑥D(zhuǎn)移盒放入電轉(zhuǎn)儀中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液。

⑤將電轉(zhuǎn)儀置于冰水中，100V 恒壓轉(zhuǎn)膜 1h。

⑥轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，快速取出 PVDF 膜，放入 5%BSA 室溫封閉 2h。

⑦取出膜，于搖床上用 TBST 洗膜 5min×3 次。

⑧孵育袋中加入 TBST 稀釋的一抗（1：500）4℃孵育過夜。

⑨TBST 洗膜 5min×3 次，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠二抗（1：3000），室溫孵育 1h。

⑩TBST 洗膜 10min×3 次。膜于化學(xué)發(fā)光檢測試劑反應(yīng)至暗處出現(xiàn)亮條帶，取出膜，甩去多余的液體，用保鮮膜包好 PVDF 膜，暗室中用 X 膠片感光、顯影、定影。